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          蛋白質氧化折疊:過去、現在和未來

          發布時間:2022年09月29日

            一、什么是蛋白質氧化折疊

            人體細胞中蛋白質組的大約1/3是分泌蛋白和膜蛋白,包括許多細胞因子、抗體、膜通道和膜受體等。這些蛋白質往往富含二硫鍵,即肽鏈上兩個半胱氨酸殘基側鏈的巰基被氧化形成的共價鍵。形成正確的二硫鍵對這些蛋白質的結構穩定性和功能完整性十分重要。含有二硫鍵蛋白質的折疊過程被稱為蛋白質的氧化折疊,氧化折疊是最復雜的蛋白質折疊問題。隨著半胱氨酸和二硫鍵數目的增多,可能的配對方式將呈現指數級增長(圖1)。在眾多可能的二硫鍵配對形式中,天然態蛋白質只具有其中的一種或有限的幾種形式。對許多特化的分泌細胞來說,蛋白質氧化折疊的壓力是難以想象的。例如,單個漿細胞每秒可以合成數千個 IgM 五聚體,這需要每秒形成約 105 個二硫鍵;一個胰島 β 細胞每分鐘可以產生大約 100 萬個胰島素分子,約300萬個二硫鍵。因此,如何高效正確地實現蛋白質氧化折疊對細胞來說是一個巨大的挑戰。

          圖1. 蛋白質氧化折疊問題 [1]

            隨著二硫鍵數目p的增加,蛋白質分子可能形成的二硫鍵異構體數目i呈指數級增長。

            二、從諾貝爾獎到胰島素合成--蛋白質氧化折疊的早期研究

            最早的蛋白質氧化折疊研究可追溯到二十世紀五六十年代。美國國立衛生研究院的Christian B.Anfinsen根據還原變性的牛胰核糖核酸酶A在去除變性劑和還原劑后,依靠空氣氧化就能夠自發地形成正確的4個二硫鍵,重新折疊成天然的三維結構并恢復幾乎全部生物活性的實驗,提出"多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學上穩定的天然構象所必需的全部信息",也就是常說的"蛋白質一級結構決定高級結構"的著名論斷 [2]。Anfinsen因此獲得1972年諾貝爾化學獎,開辟了近代蛋白質折疊的研究領域。幾乎是同時,1958 年,中國決定啟動牛胰島素人工合成工作。胰島素是由A鏈和B鏈兩條肽鏈通過2個鏈間二硫鍵連接起來的蛋白質分子,其中A鏈還含有1個鏈內二硫鍵。鄒承魯先生領導的小組在人工全合成工作中首先解決了胰島素A、B鏈二硫鍵拆合問題,為確定合成路線奠定了堅實的基礎,并提出了"天然胰島素的結構是所有AB異構物中最穩定的結構之一"的重要結論 [3]。這無疑是對蛋白質氧化折疊乃至蛋白質折疊問題的重大貢獻。

            然而,上述研究多是在體外較低的蛋白質濃度和較溫和的氧化條件下實現的,一旦蛋白質濃度提高復性產率就會大大下降。另一方面,形成二硫鍵的反應速度是相對較慢的,這樣的速度不能滿足機體生命活動的進行。1963年,Anfinsen和匈牙利科學家Brunó F. Straub(后來成為匈牙利國家主席)分別從大鼠肝臟微粒體和鴿子胰臟提取物中找到一種能夠有效促進底物蛋白質氧化折疊的物質[4-5],即蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase, PDI)。20世紀70年代末改革開放初期,"科學的春天"來到,鄒承魯先生重拾胰島素研究,謂"老題新做",即胰島素二硫鍵拆合成功的基礎研究,在中國科學院生物物理所重新揚帆啟航。王志珍老師作為其中一名重要的船員,最早成功地用PDI催化胰島素的正確重組,提出"PDI既是酶又是分子伴侶"的假說 [6],并為此假說提供了實驗支持,在國內開辟了分子伴侶和折疊酶研究的新方向。

            三、Ero1--催化二硫鍵從頭合成的氧化酶

            現在我們知道,蛋白質氧化折疊主要發生在真核細胞的內質網(endoplasmic reticulum, ER)和原核細胞的周質腔(periplasm)中。內質網擁有一整套包括折疊酶和分子伴侶在內的"質量控制"系統為蛋白質氧化折疊提供了保障。就好像北京的地鐵,每天要運送超過1000萬的乘客,不僅有志愿者作為"分子伴侶"維持秩序,還有安檢員負責處理"壞分子"。這樣,地鐵里的乘客們就能夠被縱橫交錯的地鐵網絡(很像內質網管狀網絡)有條不紊地運輸到各自的目的地。此外,內質網的谷胱甘肽還原電位(EGSH)約為-200 mV,遠高于胞漿中的-300 mV。內質網腔偏氧化的環境也有利于二硫鍵形成。

            PDI只催化巰基和二硫鍵之間的交換反應,并不增加系統的凈氧化。內質網的氧化力從何而來呢?過去很長一段時間,人們認為細胞中的氧化態谷胱甘肽(GSSG)是二硫鍵氧化的驅動力。體外實驗確實證明PDI在GSSG/GSH存在條件下能有效催化底物氧化折疊。但細胞合成的GSH又是如何氧化成GSSG的呢?人們一直在尋找那個能把O2的氧化力轉變為二硫鍵的氧化酶。1998年,美國的兩位科學家Chris A. Kaiser和Jonathan S. Weissman利用酵母遺傳學篩選手段發現了一個名叫ERO1(ER oxidoreductin 1)的基因,其缺失使得酵母對還原劑十分敏感 [7-8]?,F在我們知道,ERO1基因編碼的Ero1蛋白,是一個從酵母到人保守的巰基氧化酶。Ero1由兩個功能區組成:一個包含FAD輔基結合位點和鄰近內部活性中心的四螺旋束核心區,以及一個帶有外部活性中心的柔性環(也稱為"穿梭環"或"調節環")。外部活性中心從PDI接收電子,像一輛穿梭巴士一樣將電子轉移到內部活性中心,并通過FAD最終轉移到O2,消耗的O2被還原為等摩爾的H2O2分子(圖2A)。這一過程又被稱為"二硫鍵接力",好像接力賽跑一樣,一棒一棒地將氧化力從O2傳遞到底物(電子的流向恰好相反)。據估算,蛋白質氧化折疊過程中因此產生的H2O2可能占到蛋白質合成過程中細胞產生的活性氧的大約25%。因此,Ero1的氧化酶活性需要被精確調控,以適應分泌蛋白合成的需求同時控制氧化應激的風險。

            我在王志珍老師實驗室攻讀博士學位時,首次在體外重構了人源Ero1α-PDI氧化折疊通路,不添加GSSG/GSH就能實現底物的高效氧化折疊 [9]。我們和國際同行的工作還揭示了人源Ero1α的活力十分精巧的調節機制:如果內質網的環境偏向還原,被還原的PDI能打開Ero1α柔性環上的調控二硫鍵"開關"將其激活促進氧化折疊;反之,如果內質網的環境偏向氧化,被氧化的PDI能關閉Ero1α的調控二硫鍵"開關"使其失活防止過度氧化和氧化應激。我們近年來的工作也表明,Ero1α還可以被其他翻譯后修飾調節。在缺氧、泌乳等條件下,細胞對二硫鍵合成需求非常高,這時Ero1α可以被分泌途徑蛋白激酶 Fam20C磷酸化,磷酸化的Ero1α的氧化酶活性顯著提高。這一研究首次建立了蛋白質的磷酸化修飾與內質網氧化還原穩態之間的聯系 [10]。我們和陳暢課題組合作研究發現,衰老過程中Ero1α 還能發生亞硝基化修飾,導致其氧化酶活性降低。利用AlphaFold預測的Ero1α完整結構顯示這些修飾位點也都處于柔性環上。有意思的是,人Ero1α的柔性環松散地連接在螺旋束核心上,而酵母Ero1p的柔性環與螺旋束核心緊密相連(圖2B)。我們用酶學和結構特征分析總結發現:酵母Ero1p是一種"遲鈍"的氧化酶,對環境變化的反應性較低;人Ero1α經過進化,對各種形式的調控非常敏感。鑒于人類細胞含二硫鍵蛋白的數目和復雜程度遠高于酵母細胞,因此人類細胞對蛋白質氧化折疊的高效性和保真性有著更高的需求。Ero1α活力的快速精準調節,一方面有利于維持眾多含二硫鍵蛋白質的折疊效率,另一方面可以將內質網的過度氧化風險降至最低。

          圖2 Ero1氧化酶的功能和結構 [11]

            (A)Ero1通過柔性環(天藍色)上的外部活性中心(黃色圓點),內部活性中心(橙色圓點)以及FAD輔基(橙色六邊形)之間的"接力",將氧化力從O2傳遞到PDI進而促進底物氧化折疊。Ero1的活力還受到調控二硫鍵(連接藍色和黃色圓點)"開關"的負反饋調節。(B)用AlphaFold預測的酵母、人和擬南芥的Ero1的三維結構。在人Ero1α中,紅色和紫色小球代表磷酸化和亞硝基化位點,其余元素和(A)圖一致。

            四、PDI--負責任的二硫鍵"搬運工"

            典型的PDI由4個硫氧還蛋白(Trx)結構域a,b,b',a'以及一段b'和a'之間的x連接區組成,其中a和a'結構域各含有1個-CGHC-活性中心,負責催化二硫鍵的氧化、還原和異構反應。2013年,王志珍和馮巍課題組合作研究解析了人源PDI的晶體結構,4個Trx結構域呈"U"形排列(圖3A),揭示了PDI的構象還能被其活性中心的氧化還原狀態所調節。氧化還原偶聯的PDI構象變化使得"U"形結構能在"開放"和"關閉"之間動態切換,有利于PDI結合和釋放不同形狀、大小和折疊狀態的底物。我們近期的工作還表明,在內質網應激條件下PDI分子x連接區一個關鍵的絲氨酸殘基可以被Fam20C磷酸化,使得PDI從"U"形結構轉變為更加開放的"L"形,實現PDI從"折疊酶"到"分子伴侶"的功能轉換 [12]。這一工作揭示了PDI是一種新的應激激活的分子伴侶,極大地豐富了"PDI既是酶又是分子伴侶"的科學論斷。

            為了應對人蛋白質組中二硫鍵的高復雜度,PDI必須具備同時行使催化二硫鍵氧化和異構的能力。有意思的是,人Ero1α以劑量依賴的方式加速底物二硫鍵的氧化速率,但幾乎不影響PDI的異構酶活性。這是由于Ero1α偏好氧化PDI的a'結構域活性中心,但幾乎不氧化a結構域,使后者保持發揮異構酶活力。這樣一個精妙的機制,使得PDI能夠"一手畫圓,一手畫方",從而保證蛋白質氧化折疊的高效性和保真性?;谏锘瘜W和結構生物學數據的分子對接模型進一步證實了這一觀點(圖3B)。

          圖3 PDI及其和Ero1α復合物的結構 [11]

            (A)用AlphaFold預測的酵母、人和擬南芥的典型PDI的三維結構,黃色小球代表活性中心。(B)基于生物化學和結構生物學數據的分子對接模型顯示,Ero1α的外部活性中心接近PDI的a'結構域活性中心。

            人PDI家族多達20個成員,生理功能十分復雜。它們各司其能幫助不同蛋白質不同的折疊需求。例如,胰島β細胞中PDI敲除會導致胰島素原形成二硫鍵聯接的高分子質量復合物,低密度脂蛋白受體的錯誤二硫鍵還原和正確折疊需要ERdj5, 而分泌型IgM組裝過程中需要ERp44對其非天然二硫鍵進行重排。同時,不同成員之間還可以協同合作。具有串聯a型結構域的人PDI家族蛋白,比如ERp46和P5,能快速催化二硫鍵形成,但也容易出錯。在需要大量合成蛋白質時,ERp46/P5和異構酶PDI一起協同工作,保證迅速而又有效的氧化折疊過程。植物領域也有類似的例子,我們和呂東平課題組的合作研究發現,植物中具有串聯a型結構域的PDI-M/S蛋白可以高效地接受ERO1提供的氧化力來催化二硫鍵的形成,但異構酶活力較低。而具有典型的abb'xa'結構域排列的PDI-L成員則更多地扮演異構酶的角色。PDI-M/S和PDI-L成員的協同作用使植物能夠快速、精確地生產含多個二硫鍵的蛋白質。這些例子都告訴我們,生理條件下典型的PDI主要是發揮異構酶功能。套用一句廣告詞,PDI不直接生產二硫鍵,而是一個負責任的二硫鍵"搬運工"。

            五、蛋白質氧化折疊與人類健康

            Ero1和PDI蛋白在許多類型的癌癥中都呈高表達。人類細胞表達多種PDI同源蛋白,因此以PDI為靶點的抑制劑作為抗癌治療可能缺乏足夠的特異性。我們提出,破壞Ero1α-PDI間特異的相互作用可能是一種更特異、更有效的抗癌策略 [13]?;诮M織特異性PDI敲除小鼠的研究表明,血管內皮細胞來源的PDI與心血管疾病有關,包括血栓和血管炎癥。我們課題組的最新研究發現,Ero1α和PDI在血小板表面構成細胞外電子傳遞通路,介導血小板聚集 [14]。與僅靶向PDI的抗血栓抑制劑相比,開發小分子抑制劑靶向Ero1α和PDI之間的功能互作可能是一種新的抗血栓治療策略。內質網是調控病毒與宿主細胞互作的關鍵細胞器,PDI被報道在多種病原體的入侵過程中起作用。我們的另一項研究發現,新冠病毒輔助蛋白ORF8正是通過與PDI形成二硫鍵復合物從而逃逸降解,進而在內質網腔內累積引起宿主細胞內質網結構和功能的改變 [15]。此外,PDI在病毒表面糖蛋白的氧化折疊中也有作用。值得一提的是,冠狀病毒刺突(S)蛋白需要形成二硫鍵才能正確折疊和三聚體化。最近有研究表明,破壞新冠病毒S 蛋白的關鍵二硫鍵能降低其與宿主受體的結合,從而減弱病毒的傳染性。針對Ero1-PDI機器在S蛋白氧化折疊中的研究,將有助于開發廣譜抗冠狀病毒藥物。

            六、總結與展望

            在過去的十多年里,我們對內質網特有的酶系統如何維持蛋白質氧化折疊的效率和保真性有了更深刻的理解。Ero1-PDI氧化折疊機制已經在酵母、植物和哺乳動物中被揭示。作為一種內質網的主要氧化酶,Ero1決定了內質網較為氧化的環境,其活性和功能可被自身"調控環"上發生的各種翻譯后修飾精確控制。在高等真核生物中,豐富的PDI家族成員在蛋白質氧化折疊過程中表現出分工不同又互相協同,以保證二硫鍵形成的高效性和保真性(圖4)。

            蛋白質氧化折疊的研究已經有60多年的歷史了,在生命科學研究熱點不斷涌現的今天,算得上是一個"古老"的問題了。然而,正如許多其他的"古老"問題一樣,不斷深入的探索往往能帶給我們新的視角和新的內涵,從而引出更多新的問題。例如:體內是否存在替代Ero1催化二硫鍵從頭合成的通路?蛋白質氧化折疊過程中產生的H2O2的命運是怎樣的?各個PDI家族成員在不同生理和病理條件下的確切作用是什么?有哪些新的翻譯后修飾能調節Ero1-PDI 系統的活力?它們又是如何在不同生理病理狀態下對蛋白質氧化折疊和內質網氧化還原穩態進行時空調節?我們相信,對于蛋白質氧化折疊分子機制的深入研究,以及開發靶向Ero1-PDI相互作用的特異性抑制劑必將有助于相關疾病的治療。

          圖4 Ero1α-PDI維持人細胞內質網中蛋白氧化折疊保真性和氧化還原穩態 [11]

            七、致謝

            感謝中國科學院生物物理研究所王志珍院士和王曦副研究員對本文提出的寶貴修改意見。

            參考文獻:

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            12. Yu J, Li T, Liu Y, et al. Phosphorylation switches protein disulfide isomerase activity to maintain proteostasis and attenuate ER stress. EMBO J, 2020, 39(10): e103841

            13. Zhang Y, Li T, Zhang L, et al. Targeting the functional interplay between endoplasmic reticulum oxidoreductin-1alpha and protein disulfide isomerase suppresses the progression of cervical cancer. EBioMedicine, 2019, 41: 408-419

            14. Wang L, Wang X, Lv X, et al. The extracellular Ero1alpha/PDI electron transport system regulates platelet function by increasing glutathione reduction potential. Redox Biol, 2022, 50: 102244

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            作者簡介:

            

            王磊

            中科院生物物理研究所研究員。國家優秀青年科學基金獲得者,中科院青年創新促進會優秀會員。研究方向為內質網穩態維持的分子機制及其在人類健康中的作用。

            作者科普寄語

            探索蛋白質奧秘,致力全人類健康。

           

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